中文摘要：本发明公开了一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER?Green?I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明检测方法中，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低，和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明的优势在于通过反转录避免了RNA降解带来结果的不稳定性。
 
外文摘要：NOVELTY - Method for detecting avian influenza virus in food, involves (a) pre-treating food by under sterile environment by washing food using physiological saline, and adding into chicken embryo and culturing at 36-38 degrees C for 6-8 hours, extracting total RNA by reverse transcription, and preparing DNA, (b) constructing isothermal amplification reaction system containing DNA template, (c) performing fluorescent quantitative PCR and performing quantitative analysis of PCR products using analysis software and obtaining statistical result.
 
USE - The method is useful for detecting avian influenza virus in food (claimed).
 
ADVANTAGE - The method detects avian influenza virus in a simple and cost-effective manner, and avoids RNA degradation through reverse transcription by instability.
 
DETAILED DESCRIPTION - Method for detecting avian influenza virus in food, involves (a) pre-treating food by under sterile environment by washing food using physiological saline, and adding into chicken embryo and culturing at 36-38 degrees C for 6-8 hours, repeating washing process using saline, extracting total RNA by reverse transcription, and preparing DNA, (b) constructing isothermal amplification reaction system comprising 4 mu l DNA template, 0.3 mu l SYBR Green I (RTM: Cyanine dye) fluorescent dye, 2 mu l 10X buffer, 10 U DNA polymerase, 0.5 mu l formic acid solution, 0.1 mu l sodium sulfonate solution, 3 mu l dinucleotide triphosphate, 3 mu l DNA primer, 4 mu l citrate lyase, 1 mu l zinc stearate solution, and 30 mu l double distilled water, where the DNA template has an optical density (OD)260/280 of 1.7-1.9, the SYBR Green I (RTM: Cyanine dye) fluorescent dye is 10-20 fold dilution, the buffer comprises potassium chloride, and terpineol, and the DNA polymera!
 se is a Pfu polymerase, the concentration of methyl formate solution is 8-14 mmol/l, the concentration of the sodium sulfonate solution is 5-10 mmol/l, and the concentration of the zinc stearate solution is 20-40 mmol/l, and (c) performing fluorescent quantitative PCR at denaturation temperature of 95 degrees C for 6 minutes, or 90-93 degrees C for 0.5-1.5 minutes, annealing temperature of 60 degrees C for 45 seconds, and extension temperature of 72 degrees C for 1 minute for 38 cycles, and performing quantitative analysis of PCR products using analysis software and obtaining statistical result.
 
主权项：1.一种食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒 HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析； 具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度 为36-38℃，培养时间为6-8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随 后进行反转录，制得DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲 酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸 锌溶液 1μL，其余用dd H 2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为10-20倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的浓度为8-14mmol/L；
所述磺酸钠溶液的浓度为5-10mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述硬脂酸锌溶液的浓度为20-40mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，90-93℃变 性0.5-1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
2.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（1）中 培养温度为37℃，培养时间为7h。
3.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中 所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。
4.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中 所述SYBER Green I荧光染料为15倍稀释。
5.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中 所述甲酸甲酯溶液的浓度为11mmol/L。
6.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中 所述磺酸钠溶液的浓度为8mmol/L。
7.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中 所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。
8.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中 所述硬脂酸锌溶液的浓度为30mmol/L。
9.根据权利要求1所述的食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，具体步骤（3）中 92℃变性1.0min。
 
申请号：CN201611025762.2
公开/公告号： CN106498096A
申请日：2016-11-22
公开/公告日：2017-03-15
申请/专利权人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司
发明/设计人：吴敏芳;徐静;赵春城;胡勇;蒋韦艳;刘金杰
分类号：C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
主分类号：C12Q1/70
法律状态：实质审查
点击下载：一种食品中禽流感病毒的检测方法