中文摘要：本发明属于农产品质量安全检测技术领域，涉及农产品中AFB1的检测，具体涉及一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用。生物素标记的AFB1核酸适配体与Block探针形成的杂交复合物预先固定在磁珠表面，在靶标存才情况下，AFB1与Block探针与适配体竞争结合，被置换下来的Block探针能够触发链置换扩增反应从而产生大量的扩增子。该扩增子能够协同参与丝网印刷电极表面的表面临近杂交反应，从而引入电活性探针产生相应的电信号。通过特异性实验及与传统ELISA方法的对比，结果证明本发明特异性好、灵敏度高、准确可靠，有望为玉米农产品中AFB1的大规模筛查提供一种技术选择。
主权项：1.一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其特征在于：所述检测方法将AFB1核酸酸适配体作为分子识别元件，丝网印刷电极作为换能器，采用恒温链置换扩增方法进行信号放大后，再通过表面临近杂交反应进行信号输出。
2.如权利要求1所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其 特征在于：所述AFB 1核酸酸适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其 特征在于，包括以下步骤：
（1）磁珠的表面修饰：将生物素标记的AFB 1核酸适配体和Block探针储备液，分别经95℃ 5min，0℃ 10min的预处理，然后用AFB 1 1×BB缓冲液稀释至200nM，并于室温杂交30min，制得杂交混合液；同时，取50 µL磁珠用500 µL AFB 1 1×BB缓冲液洗涤两次；取200µL杂交混合液于离心管中加入洗涤过的磁珠，于室温下孵育15min，最后再用500 µL AFB 1 1×BB缓冲液，洗涤孵育过的磁珠两次，完成磁珠的表面修饰；
（2）丝网印刷电极的预处理及传感界面的制备：在经无水乙醇和去离子水洗涤干净的丝网印刷电极的电极表面上，滴加40 µL 0.1 M H 2SO 4溶液，在2V直流电压下活化60s，在活 化后的丝网印刷电极上，滴加4 µL含有1μM巯基修饰探针的缓冲溶液，在30℃条件下组装 3h，用AFB 1 1×BB缓冲液清洗组装后的丝网印刷电极，最后滴加4 µL 1 mM6-巯基己醇溶液于室温中封闭30min，用AFB 11×BB缓冲液清洗3次后，将丝网印刷电极吹干于4℃备用；
（3）AFB 1结合介导的链置换和表面临近杂交反应：在AFB 1靶标溶液中加入50µL步骤（1）中修饰好的磁珠，于室温下轻轻震荡孵育30 min，随后磁分离，取10 µL上清，加入10 µL 10 ×NEB buffer 3.1、2 µL 0.5 μM 链置换探针、2 µL 10 mM dNTPs、4 µL 2 U/µL聚合酶和2 µL 10 U/ µL切刻内切酶，用去离子水补充反应体系到100 µL，于55℃下反应1h；接着添加 10 µL二茂铁标记探针，混合均匀后，取40 µL滴加到（2）中，修饰好的丝网印刷电极表面室 温反应30 min，最后用1×AFB 1缓冲液洗涤干净并用氮气吹干；
（4）电化学检测：向经步骤（3）处理过的丝网印刷电极表面滴加40 µL含有10 mM MgCl 2的0.1 M KClO 4 溶液，然后进行差示脉冲电化学检测。
4.如权利要求2所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其 特征在于：所述步骤（1）中Block 探针的序列如SEQ ID NO：2所示，Block 探针储液的浓度 为10 µM；所述AFB 1 1×BB缓冲液的配方为：10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCl 2, pH 7.0。
5.如权利要求2所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其 特征在于：所述步骤（2）中巯基修饰探针的序列如SEQ ID NO：3所示，巯基修饰探针的缓冲 溶液的配方为：1μM巯基修饰探针、1M NaCl和1mM TCEP。
6.如权利要求2所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其 特征在于：所述步骤（3）中链置换探针的序列如SEQ ID NO：4所示，二茂铁标记探针如SEQ ID NO：5所示。
7.如权利要求2所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，其 特征在于：所述步骤（4）中的电化学检测在电化学工作站上进行，具体参数为窗口扫描宽度 为0-0.5 V，脉冲宽度为50 mV，静默时间0.2 s，脉冲宽度为0.06 s。
8.如权利要求1或2所述的基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB 1电化学检测方法，作为检测作物中AFB 1的应用。
 
申请号：CN201611234950.6
专利号：CN106680346-A
公开/公告号：CN106680346A
申请/专利权人：河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
发明/设计人：王红旗；刘继红；张玲；李淑芳；刘冬梅；张军锋；贾斌；孙江南；尚兵
分类号：G01N27/327
主分类号：G01N27/327
法律状态：实质审查
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