中文摘要：本发明属于黄曲霉毒素B1的定量检测领域，公开了一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，利用纳米金标记黄曲霉毒素的核酸适配体，通过黄曲霉毒素B1单克隆抗体、核酸适配体与目标物黄曲霉毒素B1结合，形成具有夹心式结构的单克隆抗体?黄曲霉毒素B1?检测探针复合物，具有更强的特异性，与待测物中的目标分子结合效果好，检测结果更加精确、定量检测范围更广，具有体积小、成本低、操作简单的特点。
主权项：1.一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物；
步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓 冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；
步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液 A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；
步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；
步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的步骤如下：
a）将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；
b）向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲 霉毒素B1的核酸适配体；
c）将步骤b）激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a）的纳米金-蔗糖酶复合 物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；
d）将步骤c）的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体混合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适 配体检测探针，并在4℃保存。
3.根据权利要求2所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH- AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
4.根据权利要求1或2所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na 2HPO 4，2mmol/L的 KH 2PO 4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。
5.根据权利要求1所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na 2HPO 4，2mmol/L的KH 2PO 4， 137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，吐温-20；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05%。
6.根据权利要求1所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na 2HPO 4，2mmol/L的KH 2PO 4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的 KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1%。
7.根据权利要求2所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述胶体金中金颗粒的直径为20nm。
8.根据权利要求2所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH为5.0。
9.根据权利要求2所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述蔗糖酶浓度为2mg/ml。
申请号：CN201710050280.0
专利号：CN106841603-A
公开/公告号：CN106841603A
申请/专利权人：郑州轻工业学院
发明/设计人：姜利英；刘帅；任林娇；张培；齐汝宾；王延峰；郑晓婉；陈青华；姜素霞
分类号：G01N33/558；G01N33/577
主分类号：G01N33/558
法律状态：实质审查
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