中文摘要：一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条。本发明属分析检测领域，公开了检测小分子物质的免疫层析试纸条：将修饰牛血清白蛋白的荧光物质分别与检测抗原以及抗免疫球蛋白G抗体混合，喷涂在试纸条特定区域上做为检测线及质控线，标记特异性单克隆抗体的银纳米粒子(银消光探针)喷涂在试纸条结合垫。当样品溶液不存在待测物时，银消光探针与检测线上检测抗原结合，吸收了荧光物质的激发光或发射光而使检测线无荧光，而质控线有荧光；当样品溶液存在待测物时，银消光探针优先与待测物结合，此时结合在检测线上的银消光探针数量减少，而结合在质控线上的银消光探针数量增加，导致试纸条检测线荧光增加，而质控线荧光下降。本发明较传统免疫层析试纸条检测小分子物质的消线判读模式更灵敏。
主权项：1.一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征是制备方法为：
(1)荧光物质与牛血清白蛋白(简称BSA)通过羧基和氨基间共价键结合所选用的荧光物质为荧光微球、量子点微球、量子点或荧光染料；荧光物质需先经过表面氨基或羧基修饰，再与BSA上的羧基或氨基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC) 活化共价结合，得荧光物质-BSA；荧光物质的最适激发波长和最大发射波长二者至少其一在400nm至500nm之间；
(2)制备银消光探针：
1)采用种子逐步生长法合成银纳米粒子，对每一步的银粒子测定紫外吸收峰，当峰值达到与所选用的配对荧光物质的最大激发波长或发射波长一致时停止生长；具体方案为： a)银种子制备：在100mL体系中调整柠檬酸钠(简称SC)浓度至5mM，单宁酸(简称TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，立即加入1mL 25mM AgNO 3，溶液马上变成亮黄色，补足体系体积至100mL，得到种子银大小约15nm的种子银溶液；b)银粒子逐步生长：在100mL体系中移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，温度设定到90℃，加入0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)，1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，搅拌30min；重复"移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，90℃搅拌30min"这一过程，紫外扫描监测银纳米粒子SPR吸收峰的变化情况，直到获得SPR吸收峰与配对荧光材料的最大激发波长或发射波长相同，得银纳米粒子；
2)银纳米粒子与待检小分子单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约为10 10至10 12)，5000转至10000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含待检小分子抗体(IgG含量1 μg至80μg)的0.1M pH 7.0-7.5硼酸溶液；20℃磁力搅拌器上搅动2h，5000转至10000转离心 10min，弃上清；沉淀重悬于pH 7.0至7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中，5min后，5000 转至10000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL pH 7.0至7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶 液中，得银消光探针，4℃保存备用；
(3)检测抗原(小分子-BSA)制备：将小分子待测物与BSA通过共价键结合；
先活化小分子待测物上非抗体识别位点的基团，然后与BSA分子上氨基或羧基通过共价键结合得小分子待测物-BSA；该方法与制备小分子人工抗原的方法相同；
(4)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装：
试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜(简称NC膜)和吸水纸等五部分组成；其中滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固 定在粘性卡纸上；其中结合垫上承载银消光探针，每个试纸条结合垫固定探针数量为10 6至10 8个；检测线上固定待检小分子的检测抗原和荧光物质-BSA，每个试纸条检测线上固定小分子检测抗原0.1μg至0.5μg；质控线上固定抗免疫球蛋白G(简称IgG)抗体即二抗和荧光物质-BSA，每个试纸条质控线上固定抗IgG抗体10ng至100ng；检测线和质控线上固定荧光物质-BSA的量均以荧光物质质量计算为1ng至50ng；距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
2.检测黄曲霉毒素M 1的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征在于制备方法如下：
待测物质为黄曲霉毒素M 1(简称AFM 1)，荧光物质为异硫氰酸荧光素微球；
(1)氨基表面异硫氰酸荧光素微球与BSA结合：
25mL磷酸盐缓冲液(简称PB，0.01M，pH 6.0)中，加入20mg氨基表面异硫氰酸荧光素微 球，5mg BSA，200μg EDC，室温搅拌45min后，再加入200μg EDC，25mg BSA，室温搅拌1h，8000 转离心10min，沉淀复溶于2mL水中，得荧光微球-BSA，4℃保存备用；
(2)银消光探针合成：
1)银纳米粒子的合成包括种子生成及逐步生长：a)银种子制备：在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM，单宁酸(TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，立即加入1mL AgNO 3 (25mM)，溶液马上变成亮黄色，补足体系体积至100mL，得到种子银大小约15nm的种子银溶 液；b)银粒子逐步生长：在100mL体系中移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，温度设定到90 ℃，加入0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)，1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，搅 拌30min；重复"移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)和 1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，90℃搅拌30min"这一过程16次，获得SPR吸收峰为494nm的银纳米粒子，与异硫氰酸荧光素微球最大激发光一致；
2)银纳米粒子与抗黄曲霉毒素M 1单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液，粒子数约6× 10 10个，5000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含AFM 1单抗20μg的0.1M pH 7.4硼酸溶液；20℃磁力搅拌器上搅动2h，离心10min，弃上清；重悬于pH 7.4含0.1％(w/v)BSA的0.1M 硼酸溶液中，5min后，5000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL pH 7.4含0.1％(w/v)BSA的 0.1M硼酸溶液，得银消光探针溶液，4℃保存备用；
(3)合成AFM 1检测抗原：
将1mg AFM 1、0.5mg琥珀酸酐和2mL吡啶混合，120℃加热回流3h，氮气吹干后用200μL二甲基甲酰胺(简称DMF)溶解，加入1mg N,N'-二环己基碳二亚胺(简称DCC)和1mg N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)，室温搅拌4h，将混合液10000转离心10min，取上清液逐滴加入2mL含10mg BSA的0.13M碳酸氢钠溶液中；室温缓慢搅拌过夜，转入4℃磷酸盐缓冲生理盐水(简称 PBS，0.01M，pH 7.4)中透析72h；
(4)银纳米粒子消光疫层析试纸条的组装：
试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成；其中，样品垫用50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含1％的BSA，0.5％的吐温20和0.05％的叠氮钠)浸润，并于60 ℃干燥2h；结合垫用0.01M的PBS(pH 7.5)缓冲溶液(包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，于 60℃干燥4h，银消光探针溶液稀释10倍后以3μL/cm的浓度喷涂在结合垫上；将检测抗原 (1.2mg/mL)与荧光微球-BSA(100μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠IgG(0.2mg/ mL)与荧光微球-BSA(100μg/mL)混合后喷涂于NC膜的质控线上，设置各线喷涂量均为0.75μ L/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；所述商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用；滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固定在粘性卡纸上；距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检 测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
3.检测猪尿中沙丁胺醇的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征在于制备方法如 下：
待测物质为沙丁胺醇，荧光物质为最大发射波长620nm的羧基表面量子点微球；
(1)最大发射波长620nm的羧基表面量子点微球与BSA结合：
25mL PB(0.01M，pH 6.0)中，加入10mg羧基表面量子点微球，200μg EDC，室温搅拌 20min后，再加入5mL BSA水溶液(0.5％，w/v)，室温搅拌1h，8000转离心10min，沉淀复溶于 2mL水中，得量子点微球-BSA，4℃保存备用；
(2)银消光探针合成：
1)银纳米粒子的合成包括种子生成及逐步生长；a)银种子制备：在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM，单宁酸(TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，立即加入1mL AgNO 3 (25mM)，溶液马上变成亮黄色，补足体系体积至100mL，得到种子银大小约15nm的种子银溶 液；b)银粒子逐步生长：在100mL体系中移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，温度设定到90 ℃，加入0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)，1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，搅拌30min；重复"移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，90℃搅拌30min"这一过程11次，获得SPR吸收峰 为450nm的银纳米粒子，与量子点微球激发光一致；
2)银纳米粒子与抗沙丁胺醇单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约1.3× 10 11个)，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含沙丁胺醇单抗5μg的0.1M硼酸溶液 (NaOH调pH至7.2)；室温搅拌2h，离心10min，弃上清；重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.2含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中，5min后，7000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL pH 7.2含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液，4℃保存备用；
(3)合成沙丁胺醇检测抗原：
1mg沙丁胺醇溶于0.5mL无水乙醇，加1mg琥珀酸酐，室温搅拌2h，氮气吹干后用200μL DMF溶解，加入1mg DCC和1mg NHS，室温搅拌4h，10000转离心10min，将上清液逐滴加入2mL 含10mg BSA的0.13M碳酸氢钠溶液中；室温缓慢搅拌过夜，转入4℃PBS(0.01M，pH 7.4)中透 析72h；
(4)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装：
试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成；其中，样品垫用50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含1％的BSA，0.4％的吐温20和0.03％的叠氮钠)浸润，室温下减湿干燥10h；结合垫用0.01M的PBS(pH 7.4)缓冲溶液(包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，室温下减湿干燥12h，银消光探针溶液稀释5倍后以3.5μL/cm的浓度喷涂在结合垫上；将检测抗原(1.0mg/mL)与量子点微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠IgG (0.25mg/mL)与量子点微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的质控线上，设置各线喷涂量均为0.77μL/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用；滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固定在粘性卡纸上；距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
4.检测鸡肉中恩诺沙星的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征在于制备方法如下：
待测物质为恩诺沙星，荧光物质为7-氨基-4-甲基香豆素-BSA(简称AMCA-BSA)；
(1)银消光探针合成：
1)银纳米粒子的合成包括种子生成及逐步生长；a)银种子制备：在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM，单宁酸(TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，立即加入1mL AgNO 3 (25mM)，溶液马上变成亮黄色，补足体系体积至100mL，得到种子银大小约15nm的种子银溶 液；b)银粒子逐步生长：在100mL体系中移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，温度设定到90 ℃，加入0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)，1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，搅 拌30min；重复"移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，0.5mL SC(25mM)，1.5mL TA(2.5mM)和 1mL AgNO 3(25mM)，补足体系体积至100mL，90℃搅拌30min"这一过程9次，获得SPR吸收峰为 442nm的银纳米粒子，与AMCA发射光一致；
2)银纳米粒子与抗恩诺沙星单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约1.6× 10 11个)，7500转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含沙恩诺沙星6.5μg的0.1M硼酸溶液 (NaOH调pH至7.5)；室温搅拌2h，离心10min，弃上清；重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中，5min后，7500转离心10min，沉淀重悬于0.25mL pH 7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液，4℃保存备用；
(2)合成恩诺沙星检测抗原：
称取1mg恩诺沙星、1mg NHS和1mg EDC，溶解于0.2mL DMF中，加入10μL三乙胺，室温搅 拌4h，逐滴加入2mL含10mg BSA的0.13M碳酸氢钠溶液中，室温缓慢搅拌过夜，转入4℃PBS (0.01M，pH 7.4)中透析72h；
(3)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装：
试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成；其中，样品垫用50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含1％的BSA，0.4％的吐温20和0.03％的叠氮钠)浸润，室温下 减湿干燥10h；结合垫用0.01M的PBS(pH 7.4)缓冲溶液(包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，室温下减湿干燥12h，银消光探针溶液稀释5倍后以4μL/cm的浓度喷涂在结合垫上；将检测 抗原(1.75mg/mL)与AMCA-BSA(60μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠二抗(0.25mg/ mL)与AMCA-BSA(60μg/mL)混合后喷涂于NC膜的质控线上，设置各线喷涂量均为0.75μL/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用；滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固定在粘性卡纸上；距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
5.检测牛奶和奶粉中三聚氰胺的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征在于制备方法如下：
待测物质为三聚氰胺，荧光物质为最大发射波长590nm的羧基表面量子点；
(1)最大发射波长590nm的羧基表面量子点与BSA结合：
20mL PB(0.01M，pH 6.0)中，加入1mg羧基表面量子点，200μg EDC，室温搅拌20min后， 再加入20mL BSA水溶液(1％，w/v)，室温搅拌1h，缓慢加入稀盐酸调pH至5.0，再19000转离 心20min，沉淀复溶于2mL水中，得量子点-BSA，4℃保存备用；
(2)银消光探针合成：
1)银纳米粒子合成：方法同权利要求3，获得SPR吸收峰为450nm的银纳米粒子，与量子 点-590激发光一致；
2)银纳米粒子与三聚氰胺单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约1.3×10 11个)，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含三聚氰胺单抗5μg的0.1M硼酸溶液(NaOH 调pH至7.5)；室温搅拌2h，离心10min，弃上清；重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.5含 0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中，5min后，7000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL pH 7.5 含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液，4℃保存备用；
(3)合成三聚氰胺检测抗原：
1mg三聚氰胺溶于0.2mL吡啶溶液中，加入丁二酸酐1mg，室温搅拌4h；氮气吹干，得到的 白色产物溶解于200μL DMF中，加入1mg NHS、1mg DCC，室温搅拌4h；将混合液10000转离心10min，取上清液逐滴加入2mL含10mg BSA的0.13M碳酸氢钠溶液中；室温缓慢搅拌过夜，转 入4℃PBS(0.01M，pH 7.4)中透析72h；
(4)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装：
试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成；其中，样品垫用50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含1％的BSA，0.4％的吐温20和0.03％的叠氮钠)浸润，室温下减湿干燥10h；结合垫用0.01M的PBS(pH 7.4)缓冲溶液(包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，室温下减湿干燥12h，银消光探针溶液稀释5倍后以5μL/cm的浓度喷涂在结合垫上；将检测 抗原(1.6mg/mL)与量子点-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠二抗(0.2mg/ mL)与量子点-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的质控线上，设置各线喷涂量均为0.85μL/ cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用；滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固定在粘性卡纸上；距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
申请号：CN201710091845.X
专利号：CN106841637-A
公开/公告号：CN106841637A
申请/专利权人：南昌大学
发明/设计人：熊勇华；江湖；郭亮；李响敏；赖卫华；聂丽娟
分类号：G01N33/68；G01N21/64
主分类号：G01N33/68
法律状态：实质审查
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