中文摘要：本发明公开了一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用，该玉米赤霉烯酮单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞克隆得到的，可用于定性检测玉米赤霉烯酮，不仅灵敏度更高，而且最低检测限更低。本发明的有益之处在于：因为采用保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞克隆得到了高灵敏度的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所以定性检测玉米赤霉烯酮时，灵敏度更高，可达到2μg/kg，最低检测限更低，可达到30μg/kg。
主权项：1.一株杂交瘤细胞，其特征在于，能够分泌高灵敏度和特异性的玉米赤霉烯酮单克隆 抗体，保藏编号为CGMCC No.13281。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
3.一种玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有由权利要求1所述 的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：提取液、稀释液和检测卡，其中，
所述提取液为60v/v％甲醇水溶液；
所述稀释液为0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；
所述检测卡由PVC底板(1)、样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、吸水滤纸(4)和NC膜(5)组 成，NC膜(5)粘贴在PVC底板(1)的中段，吸水滤纸(4)粘贴在PVC底板(1)的上段，并且吸水滤 纸(4)的下端部压住NC膜(5)的上端部，胶体金结合垫(3)和样品垫(2)均粘贴在PVC底板(1) 的下段，并且胶体金结合垫(3)的上端部压住NC膜(5)的下端部、样品垫(2)的上端部压住胶 体金结合垫(3)的下端部，其中，所述胶体金结合垫(3)做了如下处理：
取1mL浓度为0.01％的胶体金溶液并调节pH值至9.0，将由保藏编号为CGMCC No.13281 的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体按照3μg/mL标记，然后用终浓度1wt％ BSA封闭，离心去上清液后用PBS洗涤一次，再次离心后用300μL胶体金重悬液悬浮，按10μL/ cm喷金量将标记好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体包被在胶体金结合垫(3)上，37℃干燥2h；
所述NC膜(5)是通过如下方法制备得到的：
将玉米赤霉烯酮偶联BSA稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上检 测线T位置，将羊抗鼠IgG稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上质控线C 位置，37℃干燥1h，组装大板、切条，即得NC膜(5)。
5.根据权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述吸水滤纸 (4)和NC膜(5)、胶体金结合垫(3)和NC膜(5)、样品垫(2)和胶体金结合垫(3)的搭接宽度均 为1mm-2mm。
6.根据权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金溶液 的制备方法为：
在圆底烧瓶中加入1L超纯水，加热，煮沸后加入10mL 1％氯金酸溶液，2min后加入12mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸15min后停止加热，冷却至室温，即得胶体金溶液。
7.根据权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯 酮单克隆抗体的制备方法为：
用玉米赤霉烯酮偶联OVA做为免疫原免疫雌性BALB/c小鼠，第三次免疫后选择血清效 价大于或等于1:4.2×10 5的小鼠制备免疫细胞悬液，然后将免疫细胞与SP2/0骨髓瘤细胞 融合，融合后加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，将培养板置37℃、含5％CO 2的培养箱内 培养，接下来对杂交瘤细胞株进行培养、筛选和扩大培养，得到保藏编号为CGMCC No.13281 的杂交瘤细胞，最后将该杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，采用小鼠体内诱生腹水的方法制备 单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯 酮单抗制备完毕后需要纯化，纯化的方法为：
先采用二氧化硅吸附法预处理腹水，然后采用辛酸－硫酸铵沉淀法或者亲和层析法纯 化IgG。
9.利用权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒定性检测玉米赤霉烯酮的方 法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：称取5±0.05g样本到50mL离心管中，加入20mL提取液，振荡提取3min-5min；
Step2：于4000rpm离心5min，取上清液40μL，根据检测限加入适量稀释液，得到待测液；
Step3：在20℃-30℃环境下，将检测卡平放在桌面上，用滴管垂直滴加3滴待测液至加 样孔中，10min-15min内观察结果。
申请号：CN201710124541.9
专利号：CN106950375-A
公开/公告号：CN106950375A
申请/专利权人：重庆市畜牧科学院;北京龙科方舟生物工程技术有限公司
发明/设计人：李成洪；龙定彪；宋青龙；唐红梅；唐达；傅巍；张海燕；李悦
分类号：G01N33/577
主分类号：G01N33/577
法律状态：实质审查
点击下载：一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用