中文摘要：本发明涉及一种同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条的检测线上分别上包被黄曲霉毒素?牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。其可用于样品中黄曲霉毒素、甲萘威含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。
主权项：1.同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，
其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。
2.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将甲萘威单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物；所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将黄曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物。
3.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述的活化方法为取铕标记试剂，用硼酸缓冲液中超声分散，然后加缓慢加入碳二亚胺溶液，振荡活化，离心去上清液，用硼酸缓冲液复溶，备用；所述的活化时间为15-30min；所述的封闭液为含0.5-1％BSA的硼酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述铕标记试剂以有效量计与黄曲霉毒素单克隆抗体的质量比为1:(0.001-0.1)，铕标记试剂以有效量计与甲萘威抗体的质量比为1:(0.001-0.1)。
5.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品是将铕标记的单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；
所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品是将铕标记的抗甲萘威单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；
所述的抗体保护液为0.01％-0.30vt％(体积分数)的吐温-20、0.5-1.5wt％蔗糖和0.1-1wt％牛血清蛋白(BSA)水溶液。
6.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长15-35mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，2-5mm， 相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为6-15mm，每相邻两条检测线之间的间距1.5- 4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为4-10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。
7.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg，每厘米检测线所需的甲萘威-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.8-1.0μg；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3 μg，所述样品反应瓶中铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品的含量为0.2-0.4μg。
8.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)将吸水纸剪裁为吸水垫；
(2)检测垫的制备：
将黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物、甲萘威-卵清白蛋白偶联物配制成浓度0.25- 2mg/mL的包被液，用划膜方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到2条检测线，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；
将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.45mg/mL的包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4～0.8μg，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条；
按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物包被液、甲萘威-卵清白蛋白偶联物包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠 0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
9.权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒在黄曲霉毒素、甲萘威含量检测中的应用，其特征在于：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；
基于预先获得的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、甲萘威浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素、甲萘威的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、甲萘威的含量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、甲萘威浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：
(1)配制得到一系列梯度浓度的黄曲霉毒素标准品溶液；配制得到一系列浓度的甲萘威标准品溶液。
(2)将适量上述各梯度浓度的黄曲霉毒素、甲萘威标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的荧光强度值，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；
(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素浓度的关系曲线；经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与甲萘威浓度的关系曲线。
申请号：CN201611268788.X
专利号：CN106918704-A
公开/公告号：CN106918704A
申请/专利权人：中国农业科学院油料作物研究所
发明/设计人：李培武；唐晓倩；张奇；张兆威
分类号：G01N33/577；G01N33/558
主分类号：G01N33/577
法律状态：实质审查
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