外文摘要：NOVELTY - Detecting foodborne pathogenic bacteria biochip comprises e.g. (i) treating silylated slides with 5% glutaraldehyde, adding acetone, ethanol, cleaning deionized distilled water thoroughly, drying to obtain aldehyde-modified slides, (ii) designing the food-specific pathogen-specific capture probe CP, detecting probe DP, rolling ring probe RCP, target probe TP, negative control probe NC and positive control probe PC, (iii) modifying 5'-amino by the CP, providing PC and NC point in the first step on the preparation of the slide surface, treating spotted microarray with hydration.
USE - The method is useful for detecting foodborne pathogenic bacteria biochip (claimed).
ADVANTAGE - The method: detect multiple food-borne pathogenic microorganism; suitable for food, aquaculture and multiple food borne pathogenic microorganism; has rapid and accurate detection.
主权项：
1.一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步、将硅烷化处理的玻片用5％的戊二醛处理，然后依次用丙酮、乙醇、去离子蒸馏 水彻底清洗，干燥后得到醛基修饰的玻片；
第2步、设计各食源性致病菌特异性的捕获探针CP、检测探针DP、滚环探针RCP、靶标探 针TP、阴性对照探针NC和阳性对照探针PC；
第3步、将经5′-氨基修饰的CP、PC和NC点样在第1步制备的玻片表面，点样的微阵列经 水化和NaIO 4还原处理后，制备成CP、PC和NC微阵列；
第4步、将DP、RCP和待检细菌基因组gDNA混合变性后加入到第3步制备的微阵列上退火 并连接；
第5步、对第4步退火的微阵列经洗脱后，在芯片表面的基因结构中加入滚环扩增RCA反 应体系物，进行在片滚环扩增RCA并引入biotin-dUTP，经扩增和洗涤后，加入链亲和素与 RCA扩增产物结合，在一定的条件下洗脱，用近红外荧光成像仪扫描芯片，获得检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，所 述第2步的食源性致病菌包括以下任一种：单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、大肠杆菌O157、黄曲霉。
7.根据权利要求2所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，所 述第2步中所用金黄色葡萄球菌的各探针设计序列为：
TP：5′-GCCTTTACAGATAGCATGCCATACAGTCATTTCACGC-3′
CP：5′-NH 2-TTTTTTTGCGTGAAATGACTGTATGG-3′
DP：5′-CATGCTATCTGTAAAGGCTTTCGTTTCACGACGAAATAAC GGGATACAGGAC-3′
RCP：5′-CGTTATTTCGTCTATTCTACTGTATTCTGTATGTCTCCGTATCGCTGTCACCTGTGTATCTTTGAT TCGTCAGTCCTGTATCC-3′
PC:5′-NH 2-TTTTTTTTTTTGCATATGAGCGTCTCGACTTT-biotin-3′
NC：5′-NH 2-TTTTTTTTTTTCGTTACTAGTACATGCTTCGGTTT-3′。
3.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，所 述的第2步中，所述DP由三部分组成：DP-A、DP-B和DP-C；其中，DP-A序列与待检细菌基因组 gDNA特异性序列互补，检测时DP-A和gDNA结合；DP-B是DP-A和DP-C的连接区；DP-C序列与滚 环探针RCP的部分序列互补，也是滚环探针RCP的引物和连接区。
4.根据权利要求3所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，所 述的第2步中，CP序列与待检细菌基因组gDNA特异性序列互补，检测时CP和gDNA结合；CP的 5′端修饰氨基，靶标探针TP的序列与CP、DP-A连接后的序列互补。
5.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，所 述的第2步中，滚环探针RCP、阴性对照探针NC和阳性对照探针PC序列不含有与任何待检细 菌基因组gDNA序列互补的序列，NC和PC的5′端修饰氨基，PC的3′端修饰biotin。
6.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于，所 述的第4步中，所述CP和DP-A序列与待检细菌基因组gDNA特异性序列互补，它们可与待检细 菌基因组gDNA特异性序列杂交，并通过T4连接酶连接反应将CP和DP连接。
8.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌生物芯片的制备方法，其特征在于：所 述的第4步和第5步中，退火并连接及在片滚环扩增反应加入到第3步微阵列表面的基因结 构中进行反应。
申请号：CN201710301856.6
公开/公告号：CN106987641A
申请日：2017-05-02
公开/公告日：2017-07-28
申请/专利权人：徐州工程学院
发明/设计人：李同祥;黄天姿;孙会刚;汤薇;田林;王陶;李文
分类号： C12Q1/68 C12Q1/14 C12Q1/10 C12Q1/04 C40B40/06
主分类号： C12Q1/68
法律状态：审中-实质审查
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