外文摘要：NOVELTY - Qualitatively and quantitatively detecting food microorganism comprises: (a) determining target microorganism group from biological test sample, where test sample is food; (b) obtaining characteristic region of target microorganism group; (c) amplifying using multiple amplifications primers; (d) obtaining mixture sample; (e) obtaining amplification product; (f) using the amplification product for high flux sequencing; (g) obtaining high flux sequence detecting section; and (h) qualitatively and quantitatively analyzing.
USE - The method is useful for qualitatively and quantitatively detecting food microorganism (claimed).
ADVANTAGE - The method has high accuracy and high resolution detection; and is simple and fast.
主权项：
1.一种食品微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存 在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为食品；
根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目 标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微 生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；
制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述 目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域 的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所 述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；
向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；
提取所述混合样品的核酸；
利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩 增产物；
利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；
根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行 定性和定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的数目 ≥1个，且每个所述目标微生物类群包括≥0种所述目标微生物；
所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原 体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种；
所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原 体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定待测样品中的非目 标生物的方法包括：将所述非目标生物确定为除所述目标微生物类群之外的所 有生物，若能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指除所 述目标微生物类群之外的所有生物；若不能获得所述目标微生物类群的特征区 域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所述目标微生物类群之外的其它 生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的特征 区域为所述目标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列；所述目标 微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列；所述目 标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不同微生物间 保守；所述目标微生物类群的特征区域的区分度≥3；
所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述 目标微生物的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域 与所述目标微生物类群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基 数的最小值；
所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列； 所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为 单一序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的 其它生物中不具有同源性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述区分度是指由同一所述 混合多重扩增引物扩增的任一所述目标微生物类群的特征区域与任一非特征区 域间的差异碱基数的最小值，其中，所述非特征区域是所述混合多重扩增引物 以所述混合样品的核酸为模板的扩增产物，且所述非特征区域不为所述目标微 生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则所述区分度＝3×L1/4，其中，L1 为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在 提取所述混合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外 源核酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群和所述 目标微生物的定性分析方法如下：
将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对， 当差异碱基数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生 物类群的特征区域，其中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容 错碱基数；若比对成功的所述目标微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述 高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征测序片段；
将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区 域进行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生 物的标准基因型；在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微 生物的标准基因型所对应的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述 目标微生物的测试基因型与所述目标微生物的标准基因型的差异碱基数≤n2，其 中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容错碱基数，则所述目标微生 物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物的特征测序片段；
将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群， 计算获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序 片段；
若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5≥α5，则判断所述待测 样品中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障；若所述目标微生物类 群的特征测序片段存在的概率P5<α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微 生物类群；
若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6≥α6，则判断所述待测样品 中存在所述目标微生物，其中，α6为概率保障；若所述目标微生物的特征测序 片段存在的概率P6<α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；
n1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1为一条不是所述目标微生物类群的特征 测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段 而产生的假阳性的概率；P3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判 为不是所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α1和α3 为判断阈值；
n2使得P2≤α2且P4≤α4，其中，P2为一条不是所述目标微生物的特征测序 片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的 假阳性的概率；P4为一条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目 标微生物的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α2和α4为判断阈值；
P5＝1-BINOM.DIST(S1,S1,P1,FALSE)，P6＝1-BINOM.DIST(S3,S3,P2,FALSE)， S1为所有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序 片段的数量的中位数；S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生 物的特征测序片段的数量的中位数，FALSE为参数值；BINOM.DIST函数返回 一元二项式分布的概率。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群和所述 目标微生物的定量分析方法如下：
所述目标微生物类群的量M1＝Mr×S1/S2，所述目标微生物类群的量的置信 区间为[M11，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物的量； S2为所有的所述参考微生物的特征区域的所述参考微生物的特征测序片段的数 量的中位数；M11和M12分别为M1值的置信区间的下限与上限；
所述目标微生物的量M2＝M1×S3/S1，所述目标微生物的量的置信区间为 [M21，M22]，M21和M22分别为M2值的置信区间的下限与上限；
M11＝M1×(1-S4/S1)，M12＝M1×(1+S5/S1)，M21＝M2×(1-S6/S3)，M22＝M2× (1+S7/S3)；其中，S4为假阳性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且 S4＝CRITBINOM(nS,P1,α9)，其中，nS为计算S1的所述目标微生物类群的特征 区域的所述多重扩增引物所扩增的所述非特征区域的所述高通量测序片段的数 量；S5为假阴性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且S5＝CRITBIN OM(S1,P3,α9)，其中，α9为概率保障；S6为假阳性的所述目标微生物的特征测 序片段的数量且S6＝CRITBINOM(S1,P2,α10)，S7为假阴性的所述目标微生物的 特征测序片段的数量且S7＝CRITBINOM(S3,P4,α10)，其中，α10为概率保障；C RITBINOM函数返回使累积二项式分布大于等于临界值的最小值。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，P1＝BINOM.DIST(n1,m1,1-E, TRUE)，P2＝BINOM.DIST(n2,m2,1-E,TRUE)，P3＝1-BINOM.DIST(n1,L1,E,TRU E)，P4＝1-BINOM.DIST(n2,L2,E,TRUE)，其中，m1为所述区分度；所述m2为 所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的其它所述微生物间差异碱 基的最小值；L1为所述目标微生物类群的特征区域的长度；L2为所述目标微生 物的标准基因型的长度；E为碱基错误率。
申请号： CN201610061063.7
公开/公告号： CN105567831A
申请日：2016-01-29
公开/公告日：2016-05-11
申请/专利权人：江汉大学
发明/设计人： 陈利红;方治伟;彭海
分类号： C12Q1/68 C12Q1/04 C12Q1/06
主分类号： C12Q1/68
法律状态：审中-实质审查
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