中文摘要：本发明提供了一种支原体的检测方法及检测试剂盒。所述检测方法将PCR技术与ELISA技术相结合，是一种半定量核酸检测技术，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、灵敏度提高、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。所述检测试剂盒，结构简单，操作方便，能够一次性满足所述检测方法需要的试剂，提高了实验人员的工作效率。
主权项：1.一种支原体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、取待测样品：取待测细胞上清液作为样本；
B、PCR反应：以步骤A中的上清液为模板，进行PCR反应，得到PCR反应产物；
C、ELISA反应：对步骤B中得到的PCR反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反 应，ELISA反应结束后分别测量所述PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；
D、确定样品浓度：根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系 曲线；依照所述关系曲线，根据所述PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据 所述PCR反应产物的浓度，计算得到所述待测样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中，取培养时间为3-7天的细胞 培养液的上清液作为样本。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，使用被荧光标记的引物，所 使用的引物的荧光标记方法为：用5’端标记生物素的引物用于PCR扩增，PCR反应双链产物 的一条链便带有生物素，所述生物素作为标记物。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，PCR反应体系包括引物、dNTP mixture、Buffer、Takara Ex Taq和样本，所述PCR反应体系的总体积为25μL，其中各组分的 含量或浓度为：引物浓度为10pmol/ul，dNTP mixture的浓度均为2.5mmol/L，样本含量2μL， 余量为水。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，PCR反应中使用的PCR扩增程 序为：在94℃温度下预变性1min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在 94℃温度下预变性1min，在55℃温度下退火2min；在72℃温度下延伸1min；在完成35个循环 之后，即完成PCR扩增程序。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤C中，所述ELISA反应为：对步骤B 中得到的PCR反应产物和不同浓度的标准品分别加入到附有亲和素的酶标板上，胶板覆盖， 依次进行孵育和清洗；然后在所述酶标版上加入一抗，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；然 后在酶标版上加入二抗，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；孵育完成后，加入3，3'，5，5'-四 甲基联苯胺，避光；最后加入停止液，终止反应后分别测量所述PCR反应产物和不同浓度标 准品的OD450值。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，每次清洗使用1XWashing Buffer洗3 次。
8.根据权利要求1-7任一所述的检测方法，其特征在于，步骤B中，增加阳性对照组：所 述阳性对照组加入阳性模板，其余设置与步骤B中的所述PCR反应设置相同。
9.一种用于支原体的检测方法的检测试剂盒，其特征在于，包括盒体、试剂瓶、八连管 (10)和八连管架(11)，所述盒体的底部设置有固定层，所述固定层上开设有多个固定孔，所 述试剂瓶设置在固定孔内，所述试剂瓶包括PCR反应液试剂瓶(1)、阳性模板试剂瓶(2)、标 准品试剂瓶(3)、稀释液试剂瓶(4)、清洗液试剂瓶(5)、一抗试剂瓶(6)、二抗试剂瓶(7)、显 色液试剂瓶(8)和终止液试剂瓶(9)；所述八连管(10)和八连管架(11)设置在所述盒体的内 部。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液试剂瓶(1)中装有PCR反 应液试剂，阳性模板试剂瓶(2)中装有阳性模板试剂，标准品试剂瓶(3)中装有标准品试剂， 稀释液试剂瓶(4)中装有稀释液试剂，清洗液试剂瓶(5)中装有清洗液试剂，一抗试剂瓶(6) 中装有一抗试剂，二抗试剂瓶(7)中装有二抗试剂，显色液试剂瓶(8)中装有显色液试剂，终 止液试剂瓶(9)中装有终止液试剂。
申请号：CN201610478333.4
公开/公告号：CN106198968A
申请日：2016-06-27
公开/公告日：2016-12-07
申请/专利权人：武汉思安医疗技术有限公司
发明/设计人：董坚;杨益;刘玉芝;何群;蔡敏;方捷
分类号：G01N3
主分类号：G01N3
法律状态：实质审查
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