中文摘要：本发明公开了一种用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法。本发明创造性地通过比较选择不同种别的支原体中所共有的保守序列进行PCR引物的设计选择，设计特异性的PCR引物用于扩增支原体16sRNA和23sRNA间的间隔区的一端基因片段，该基因片段涵盖多数的支原体种别，因而可以用于针对多种别的支原体进行PCR扩增检测。并且由于各种别间隔区基因结构不同，从而可以根据扩增产物的大小和酶切部位的不同，作为鉴别种别的根据，为支原体的种别鉴定提供了技术支持。该用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法灵敏度和检测准确性高，可广泛推广应用于支原体的检测。
主权项：1.一种用于检测支原体的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。 2.一种用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，使用含限制性内切酶识 别位点序列及SEQ ID NO:1所示序列的上游引物和含限制性内切酶识别位点序列及SEQ ID NO:2所示序列的下游引物对含有支原体的模板进行PCR扩增，并将PCR扩增得到的产物酶切 后转入同样酶切的表达载体中，得到的连接产物转化细菌细胞，筛选阳性克隆，提取质粒即 得。 3.如权利要求2所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，所述上游 引物中限制性内切酶识别位点序列为BamH I识别位点序列，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示；所述下游引物中限制性内切酶识别位点序列为Ecor I识别位点序列，所述下游 引物的序列如SEQ ID NO:4所示。 4.如权利要求3所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，PCR扩增 程序为：95℃变性2～5min后进入循环，循环的参数为95℃，30s；58℃，30s；72℃，30～40s， 30～40个循环后在72℃延伸5～7min。 5.如权利要求3所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，所述表达 载体是pc DNA 3.1(+)。 6.如权利要求5所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，在将PCR 扩增得到的产物酶切后转入同样酶切的表达载体中时，将PCR扩增得到的产物与表达载体 分别酶切后，再按照物质的量8～3:1的比例将酶切后的PCR扩增得到的产物与酶切后的表 达载体混合，并加入T4DNA连接酶进行连接反应。 7.一种用于检测支原体的阳性质粒，其特征在于，采用如权利要求2～6中任一项所述 的构建方法构建得到。 8.一种用于检测支原体的试剂盒，其特征在于，包括含有PCR引物的试剂和阳性质粒， 所述含有PCR引物的试剂中的PCR引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述 阳性质粒为权利要求7所述的用于检测支原体的阳性质粒。 9.如权利要求8所述的用于检测支原体的试剂盒，其特征在于，所述含有PCR引物的试 剂中PCR引物的浓度是4μM，所述含有PCR引物的试剂中还含有1～1.5U的Taq DNA聚合酶、浓 度为150～200μM的dNTP以及浓度为1.8～2.5mM的Mg2+。 10.一种细胞培养时支原体的检测方法，其特征在于，使用如权利要求8或9所述的用于 检测支原体的试剂盒，所述检测方法包括如下步骤： 直接将待测细胞培养样品与所述含有PCR引物的试剂混合，进行PCR扩增； 以所述阳性质粒为模板与所述含有PCR引物的试剂混合，进行PCR扩增； 比较所述待测细胞培养样品与所述阳性质粒的PCR扩增结果。
申请号：CN201710321501.3
公开/公告号：CN106939353A
申请日：2017-05-09
公开/公告日：2017-07-11
申请/专利权人：广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院）
发明/设计人：高应棋;漆彦斌;刘华敏;王光勇;黄书贵
分类号：C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12N15/66;C12N15/70
主分类号：C12Q1/68
法律状态：实质审查
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