中文摘要：本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法。具体步骤如下：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1%的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；用基因工程的方法将扩增后的番茄PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中；农杆菌转化及培养；配制转化菌液；玉米种子侵染。玉米基因组复杂，突变体不易获得，遗传转化困难且受基因型限制，本发明首创利用利用TRV、采用番茄PDS病毒基因对玉米种子进行病毒载体的侵染，进而实现玉米PDS基因沉默，本发明方法简便、快捷、高效、低成本、不需要基因转化，且本发明为全株沉默，效率高，方便研究目的基因在各个组织中功能。
主权项：一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤(1)：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1%的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；步骤(3)农杆菌转化及培养：3.1)将pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1:1混合，TRV1与TRV-SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600=0.04-1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；步骤（4）配制转化菌液：向步骤（3）所得的菌液中加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；步骤（5）玉米种子侵染：含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV-SlPDS的转化菌液侵染步骤（1）处理过的玉米种子，继续培养，观察表型，提取RNA使用半定量RT-PCR方法检测被沉默玉米中PDS基因转录本的沉默效果。
申请号：CN201611082938.8
公开/公告号：CN106520828A
申请日：2016-11-30
公开/公告日：2017-03-22
申请/专利权人：周口师范学院
发明/设计人：李成伟 ; 张菊 ; 于德水 ; 王健 ; 陈璨 ; 刘坤 ; 徐克东 ; 张怡 ; 谭光轩 ; 张福丽 ; 廖立冰
分类号：C12N15/83 ; A01H5/00
主分类号：C12N15/83
法律状态：实质审查
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